Contar con suficiente cantidad y calidad de proteínas S de la envoltura del SARS-Cov-2 no solo resulta clave para comprender en profundidad el proceso infeccioso, sino también puede contribuir al desarrollo de nuevas técnicas de detección del virus y de posibles estrategias terapéuticas antivirales. La doctora  María Victoria Miranda, del Instituto de Nanobiotecnología, junto la doctora Lucía Cavallaro y el doctor Matías Fingermann, nos explican el alcance del proyecto que encaran para producir mediante herramientas biotecnológicas esa proteína crucial.

Las imágenes virtuales tridimensionales y también las obtenidas por microscopia electrónica del SARS-Cov-2 forman parte  hoy de la cotidianeidad para la gran mayoría de los terrícolas. Ese ultrapequeño virus esférico de cuya envoltura emergen unas estructuras espiculares, cual si fueran agujetas o espigas, que lo hacen lucir semejante a una corona y le dan su nombre de ´corona´virus, se nos aparece hasta en los sueños. Ahora bien, esas espículas que lo caracterizan  –las proteínas S, de spike, espiga en inglés- podrían constituir, inopinadamente, su talón de Aquiles, tanto para diagnosticarlo lo más rápidamente posible, como para controlarlo y, eventualmente, hasta aniquilarlo.

El estudio de esta proteína estructural del SARS-Cov-2 ha concitado la atención de numerosos grupos de investigación en todo el mundo. En la Facultad de Farmacia y Bioquímica, el equipo liderado por la doctora María Victoria Miranda, profesora titular de la Cátedra de Biotecnología e investigadora principal en el Instituto de Nanobiotecnología (NANOBIOTEC, UBA-CONICET), fue seleccionado en la convocatoria extraordinaria de la Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación (Agencia I+D+i). El proyecto se titula  “Producción biotecnológica de la proteína S completa de SARS-Cov-2 y péptidos sintéticos para fines diagnósticos y terapéuticos”. La doctora Miranda y diversos miembros del equipo de investigación nos explican, a continuación, los objetivos y expectativas de logro del proyecto en esta entrevista con En Foco.

La proteína S resulta clave en el proceso infeccioso, en tanto que es responsable de la fusión de la membrana del virus con la de la célula que va a infectar, ¿podría explicarnos como sucede este proceso?

Como señala la doctora Lucía Cavallaro, directora del Departamento de Microbiología, Inmunología, Biotecnología y Genética de la Facultad de Farmacia y Bioquímica y presidenta de la Sociedad Argentina de Virología: “La proteína S es la glicoproteína de envoltura del SARSCoV2 que se dispone en trímeros en forma de espículas que protruyen en la superficie celular.

La proteína S es clivada por proteasas tipo furina en dos péptidos S1 y S2. En la subunidad S1 se encuentra el dominio de unión al receptor (RBD, receptor-binding domain). La subunidad S2 contiene el péptido de fusión, responsable de la fusión de las membranas viral y celular, durante la entrada del virus a la célula, así como de la formación de sincicios, que puede producir este virus en la fase tardía de la infección de células en cultivo o en la infección in vivo.

La proteína S debe ser clivada por una proteasa para poder ser infectivo el virus. Puede ser que ese proceso ocurra intracelularmente o fuera de la célula. Este requerimiento es el fundamento por el cual se evalúan los inhibidores de proteasa de HIV en la terapia de COVID 19.

¿Qué implica producir biotecnológicamente la proteína S completa y péptidos sintéticos? ¿Podría relatarnos cómo trabajan ustedes para elaborarlos?

Por su parte, la doctora María Victoria Miranda explica que “el grupo de investigación de NANOBIOTEC, bajo mi dirección, ha focalizado su trabajo en el estudio de la implementación de larvas de insectos lepidópteros como plataforma biotecnológica de bajo costo para la producción de proteínas recombinantes de interés comercial. En este sentido, hemos evaluado la capacidad de producción de proteínas recombinantes en distintas especies de insectos que constituyen importantes plagas en Argentina. Especies de lepidópteros, como Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda, son criadas en condiciones de laboratorio en la empresa Agidea SRL, con la que venimos trabajando conjuntamente en esta línea hace unos 10 años”.

“Las larvas de insectos –continúa Miranda– han resultado adecuadas para expresar una variedad de proteínas complejas estructuralmente utilizando como vector al baculovirus. Sobre la base de nuestra experiencia, observamos que la plataforma es altamente productiva para la expresión de proteínas de naturaleza viral. Por ejemplo, hemos expresado en larvas un dominio de la proteína E de los 4 serotipos del virus del dengue para el desarrollo de kits de diagnóstico por enzimoinmunoensayo.

Poder expresar la proteína S completa, y que pueda adoptar la conformación trimérica en el espacio, plantea un desafío biotecnológico importante. Consideramos que contar con la expresión de la proteína S en estado pre-fusión es clave para el desarrollo de métodos de diagnóstico, de herramientas terapéuticas y el diseño de vacunas. En este Proyecto nos proponemos encarar la producción recombinante de proteína S de SARS-CoV-2 utilizando el sistema de baculovirus/larvas de insectos. Para ello, junto al doctor Leonardo Alonso diseñamos un gen sintético que codifica la proteína S en la que se introdujeron una serie de mutaciones que eliminaron los sitios internos de proteólisis y otras mutaciones que estabilizan la conformación pre-fusión. Dada la complejidad estructural de la proteína creemos que el sistema baculovirus/larvas de insectos es ideal para abordar su producción recombinante. Este trabajo será desarrollado activamente por la doctora Alexandra Targovnik, el doctor Federico Wolman y todo mi equipo de investigación.

Por otra parte, en estudios previos con SARS-CoV, fueron evaluados los epitopes de la proteína S y, sobre esta base, se han diseñado péptidos adecuados tanto para el diagnóstico como para el desarrollo de vacunas. De manera similar, péptidos que contengan epitopes de la proteína S de SARS-Cov-2 pueden ser utilizados en sistemas de diagnóstico para detectar los anticuerpos (Ac) anti-proteína S en personas que hayan tenido contacto con el virus.

Entonces, en el marco de este Proyecto y, mediante el uso de herramientas bioinformáticas, se sintetizarán químicamente péptidos que contengan fragmentos de ACE2 con afinidad por la proteína S y péptidos que contengan epitopes de la proteína S para su aplicación en sistemas de diagnóstico serológico de la infección por SARS-CoV-2. Asimismo, los péptidos diseñados serán propuestos como posibles candidatos terapéuticos o vacunales. Este trabajo será desarrollado por la doctora Silvia Camperi y su grupo de colaboradores en NANOBIOTEC”.

Estas proteínas que van a producir, ¿cómo operarían en instrumentos de diagnóstico de la Covid-19?

Dice la doctora Lucía Cavallaro: “El diagnóstico de la infección en curso se realiza por la detección del genoma viral mediante RT PCR en tiempo real. Esa es la técnica gold standard. Sin embargo, tener un test de detección de anticuerpos (Ac) IgM e IgG permitiría aumentar la sensibilidad diagnóstica en aquellos pacientes con sintomatología leve o asintomáticos que pueden tener bajos niveles de replicación viral y durante menos tiempo. Estos pacientes pueden ser negativos por RT PCR en tiempo real pero podrían ser detectados mediante la medición de Ac específicos de SARS CoV 2. Si resulta positivo, puede tener valor diagnóstico ya que dará cuenta de que ese individuo ha estado infectado con el virus. Hay trabajos que reportan un aumento significativo en la detección de infectados cuando se puede complementar con un buen método serológico la técnica molecular de detección de genomas virales.

La proteína S es muy inmunogénica y muchos de los anticuerpos dirigidos contra el dominio RBD (antirreceptor) son neutralizantes (AcN). Estos Ac compiten con ACE2 por la unión a RBD y bloquean la posibilidad de interacción de RBD-ACE2 y en consecuencia el virus no puede unirse a la célula hospedadora para infectarla. Por otro lado, se ha visto que los AcN para SARS CoV 2 no dan reactividad cruzada frente al mismo dominio de MERS CoV y de SARS CoV.

Por otro lado, S1 es la porción más variable de la proteína S mientras que S2 es altamente conservada. En la proteína S1 se encuentran epitopes conservados y no conservados distribuidos en la proteína. Los más conservados son compartidos con los otros coronavirus y sobre todo con MERS CoV más aún que con SARS CoV. Pero entre los dominios no conservados y que serían más representativos de cada virus, en general se deduce por estudios in silico que son las regiones donde se encuentran los epitopes para Ac con mayor score. Estos serían los que pueden contribuir a la especificidad del método. Además, en el mismo sentido, es que se plantea el agregado de péptidos que representan los epitopes con mejor score y esto también debería aumentar la S y la E del método de detección. En este Proyecto se busca diseñar una configuración que permita detectar IgM e IgG y será llevado adelante bajo la dirección de la doctora Silvina Valdez, del Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU, FFyB).

Y, con base en la pregunta anterior, ¿cómo contribuirían en el desarrollo de potenciales herramientas terapéuticas?

En este caso, nos responden los doctores Lucia Cavallaro y Matías Fingermann: “Dada la importancia que se remarcó de los Acs dirigidos a la proteína S y la posibilidad de bloquear la infección, esa proteína puede ser utilizada para la obtención de sueros hiperinmunes que pudieran ser utilizados o bien como fuente para obtener las IgGs específicas y que esa solución de gamaglobulinas anti SARSCoV 2 (o partes de ellas) pueda ser administrada a un paciente en el momento de la infección que pudiera ser definido como el más adecuado.

Si bien han pasado alrededor de 100 años desde que este tipo de herramientas terapéuticas fueron usadas por primera vez, siguen teniendo vigencia. Más aún, el tratamiento de casos de envenenamiento por mordedura de serpientes o picadura de escorpiones en nuestro país es hoy en día realizado con las mismas herramientas terapéuticas a las cuales se alude, bajo el rótulo de antivenenos. Su producción y distribución es realizada en forma gratuita por el Estado nacional a través del Instituto Nacional de Producción de Biológicos  (INPB) de la ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Por lo tanto, una vez disponible la proteína S, ésta podrá ser usada para el desarrollo de un producto terapéutico mediante la misma plataforma bajo la cual hoy en día se producen los antivenenos en la mencionada institución pública.

En este sentido, podría interpretarse como el cierre de un círculo virtuoso en el cual los fondos públicos puestos en juego para el desarrollo en ciencia y tecnología resultan en herramientas diagnósticas y terapéuticas a ser producidas y distribuidas gratuitamente a través del brazo ejecutor del mismo Estado nacional para la producción de productos biológicos.

También puede ser la base para la formulación de una vacuna en el futuro. Los plazos (y costos) requeridos para desarrollar e implementar una vacuna frente al SARS-CoV-2 son mayores a los de herramientas terapéuticas como las descriptas. Por lo tanto, el desarrollo de una vacuna no sería la estrategia preferencial y de primera línea frente a una situación de emergencia sanitaria como la presente.

En el Instituto de Nanobiotecnología se registra una amplia trayectoria en la producción de diversas proteínas recombinantes, ¿en cuánto consideran que esta masa crítica de profesionales formados y conocimientos acumulados en el Instituto podrán facilitar el logro de los objetivos propuestos?

Nos responde la doctora María Victoria Miranda: “En el marco de este Proyecto, estimamos que una vez iniciado podemos contar con la proteína recombinante y péptidos sintéticos en 2 meses, aproximadamente. A partir allí se trabajará en el diseño de métodos de ELISA y la validación de los kits estará a cargo del INPB ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” bajo la dirección del doctor Matías Fingermann. De contar con los resultados propuestos, INPB será el adoptante del kit de diagnóstico para la producción y puesta a disposición en forma gratuita al sistema nacional de salud pública.

Es importante recalcar que este Proyecto cuenta con 29 participantes, investigadores formados, profesionales de diferentes áreas que actualmente están desarrollando el doctorado en la UBA, técnicos profesionales expertos y entomólogos. Además, quiero valorar especialmente que se haya sumado al Proyecto Mariano Battista, socio y fundador de la empresa Agidea quien nos apoya en cada una de nuestras líneas de investigación desde hace años. La provisión de larvas es muy importante para nosotros porque constituyen la base de nuestra plataforma biotecnológica.

Izq. a der. doctora María Victoria Miranda, doctora Lucía Cavallaro, doctor Matías Fingermann.

Entrevista: Amalia B. Dellamea y Leonardo Santolini, Equipo de Gestión Editorial de En Foco