Una protagonista crítica y esencial de varios de los trabajos seminales de Eduardo De  Robertis, que se presentan en la nota principal de la sección Papers imperdibles, fue la doctora Georgina Rodríguez de Lores Arnaiz, profesora de Farmacología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (UBA). En esta entrevista de FFyB En Foco, comparte un relato de sus experiencias en el laboratorio dirigido por De Robertis, así como un detallado panorama de los desarrollos y descubrimientos realizados por el equipo de investigación de la UBA.

¿Por qué decidió hacer investigación y cómo fue su ingreso al Laboratorio del doctor De Robertis?

Llegando al final de la carrera de Bioquímica la idea de hacer investigación me resultaba sumamente atrayente pero muy alejada de la realidad. Era un camino más raro y difícil de abordar que en la actualidad… No se sabía a dónde ir y no había cargos con dedicación exclusiva en la Universidad de Buenos Aires. Se puede señalar que el CONICET fue creado en 1958, organismo que instituyó las primeras becas de iniciación en la investigación a las que siguieron las becas de la UBA, que resultaron esenciales para los jóvenes que se interesaran por la investigación científica.

Ingresé al laboratorio del doctor De Robertis cuando era estudiante del último año de la carrera de Bioquímica. Durante una clase de Química Biológica Patológica, el profesor doctor Carlos Jorge Gómez nos habló acerca de un proyecto en el que estaba trabajando con el doctor De Robertis en la Facultad de Medicina, sobre “Aislamiento de fracciones del cerebro”. Nos adelantó que podría haber lugar para alguno de nosotros que estuviera interesado en colaborar en ese proyecto. Al manifestar mi interés por participar en esa actividad, Gómez me acompañó a una entrevista con De Robertis. De nombre era bien conocido entre los estudiantes de Bioquímica porque recurríamos a su libro para preparar temas de Biología Celular. Me sorprendió que fuera tan joven dado que ya era una personalidad muy destacada en nuestro medio.

En el contexto actual donde se discuten las condiciones para la igualdad de género, ¿qué nos puede contar sobre su experiencia de formar parte de un laboratorio de investigación en las décadas de 1960-70 comparadas con las actuales?

En relación con las condiciones actuales con respecto a las de aquellas décadas puedo mencionar algunas diferencias:

Había pocas mujeres en el laboratorio y en el Instituto en general. Esa relación fue cambiando mucho en el tiempo. Por ejemplo, en el Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN) CONICET-UBA, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, donde continúo desarrollando mi actividad de investigación, hay más del doble de becarias con respecto al número de becarios. La implementación de becas de iniciación en la investigación y de perfeccionamiento de la UBA y del CONICET contribuyó notablemente al aumento de jóvenes que se fueron incorporando a los laboratorios de investigación. También han contribuido las becas de otras instituciones privadas, como las otorgadas por laboratorios de la industria nacional y organizaciones del exterior, y distintas fundaciones, entre otras.

¿Cómo era un día de trabajo allí? ¿Cómo estaba estructurado el laboratorio?

Cuando me incorporé al laboratorio, ya trabajaba con De Robertis la doctora Amanda Pellegrino de Iraldi, quien fue su discípula y estrecha colaboradora durante largos años.

La mayor parte de los primeros experimentos de fraccionamiento celular del cerebro los realizamos con Pellegrino de Iraldi y, frecuentemente, intervenía De Robertis, muy interesado en todo lo relacionado con esa actividad. Contábamos con la eficiente ayuda técnica de Miguelina Levien en la preparación de las muestras para su posterior estudio al microscopio electrónico.

El día del fraccionamiento subcelular comenzaba a las 8-8.30 hs (machacando bloques de hielo, no había granizadora…) y terminaba aproximadamente las 20, cuando las muestras se dejaban en el congelador para luego hacer ensayos bioquímicos o se dejaban con el fijador para su estudio al microscopio electrónico.

¿Cuáles fueron sus principales aportes y los del grupo al conocimiento de la Neurobiología?

Como se mencionó en la nota de En Foco que esta entrevista acompaña, uno de los aportes fundamentales de De Robertis para la Neurobiología fue el descubrimiento de las vesículas sinápticas, realizado en colaboración con Bennett, publicado en 1955 en el The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. Esta publicación fue luego incluida en Special Collection del Journal of Cell Biology 65: Trafficking and Organelles.

A partir de 1962 el Journal of Biophysical and Biochemical Cytology se denominó Journal of Cell Biology, siendo una de las revistas más prestigiosas en el campo de la Biología Celular.

En ese trabajo, los autores postularon que las vesículas sinápticas serían las organelas que desempeñarían un papel clave en la neurotransmisión. Su número y apariencia al microscopio electrónico cambiaba según la frecuencia de estimulación del nervio. En esa etapa, era crucial demostrar que contenían el neurotransmisor. Para ello, un camino implicaba aislar primero las vesículas sinápticas para luego realizar los ensayos correspondientes.

El enfoque consistió en la aplicación de métodos de fraccionamiento celular, que estaban descriptos para el tejido hepático [1].

Esta metodología implicaba que, luego de la homogeneización del tejido en un medio isotónico, una centrifugación diferencial permitía separar cuatro fracciones: nuclear, mitocondrial, microsomal y sobrenadante final. Al aplicar la metodología al fraccionamiento de la corteza cerebral de rata, observamos en la fracción mitocondrial, junto con las mitocondrias, terminaciones nerviosas intactas, que contenían en su interior, numerosas vesículas sinápticas y algunas mitocondrias (Figura 1).

Estos resultados fueron presentados en las Primeras Sesiones Científicas de Biología, Mendoza, 5 al 8 de octubre de 1960, y se publicaron en: De Robertis, E.; Pellegrino de Iraldi, A.; Rodríguez, G.; Gómez, C. J. (1961). On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. J. Biophys. Biochem. Cytol. 9, 229‑235.

Fig. 1. Micrografía electrónica de la fracción “mitocondrial cruda” de corteza cerebral de rata. En el panel de la izquierda se observan mitocondrias libres (mi) y numerosos terminales nerviosos (sinaptosomas) con vesículas sinápticas (sv) y algunas mitocondrias en su interior. En el panel de la derecha se observan tres terminales nerviosos con vesículas sinápticas y dos mitocondrias en su interior.

Reproducido de De Robertis, E.; Pellegrino de Iraldi, A.; Rodríguez, G.; Gómez, C. J. (1961). On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. J. Biophys. Biochem. Cytol. 9, 229‑235.

Simultáneamente, Gray, Whittaker y colaboradores observaron la presencia de terminaciones nerviosas libres en la fracción mitocondrial de cerebro [2].

Para aislar las vesículas sinápticas, en el laboratorio se realizaron distintos intentos: cambio de las condiciones de homogeneización, como la luz entre el vástago y el tubo; y la velocidad de rotación del vástago; las condiciones velocidad y tiempo de centrifugación, etc.

El objetivo se logró cuando homogeneizamos en agua bidestilada el sedimento mitocondrial de la corteza cerebral, donde estaban las terminaciones nerviosas junto a las mitocondrias. Mediante ese choque osmótico, se produjo la apertura de la membrana que rodea al terminal nervioso con liberación de las vesículas de su interior, que eran recuperadas en el sedimento, luego de una nueva centrifugación (Figura 2).

En la fracción de vesículas sinápticas se encontraba concentrado el neurotransmisor acetilcolina y la enzima de síntesis, la colina acetiltransferasa (De Robertis y col., 1962; 1963) [3, 4].

Fig. 2. Micrografía electrónica de la fracción de vesículas sinápticas, cortesía de la Dra. Amanda Pellegrino de Iraldi.  La foto fue la portada del Libro de Resúmenes de la V Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Neuroquímica (SAN), actualmente Sociedad Argentina de Investigación en Neurociencias. Fotos originales en Ref. [3].

Por otra parte, la aplicación de una centrifugación en gradiente de sacarosa a la fracción mitocondrial cruda nos permitió separar dos tipos de terminaciones nerviosas, que denominamos colinérgicas y no-colinérgicas, diferenciables según su contenido en acetilcolina y actividad de acetilcolinesterasa [5].

Ese trabajo, publicado en el Journal of Neurochemistry en 1962 mereció la denominación de “Citation Classic” en Ciencias Biológicas (Current Content, 6 de septiembre de 1982) (Figura 3). El Science Citation Index (SCI) informó que este artículo había sido mencionado en más de 610 publicaciones desde su aparición en 1962, siendo uno de los más citados entre los trabajos publicados en el Journal of Neurochemistry, revista oficial de la International Society for Neurochemistry (ISN).

Fig. 3. Reproducción de la denominación de "citation Classic" en Ciencias Biológicas (Current Content, 6 de septiembre de 1982)

Uno de los principales aportes tuvo y tiene que ver con el aislamiento de las vesículas sinápticas. En esa época existían dos grupos que “competían” para alcanzar ese objetivo, entre otros (también relacionado con la compartimentalización de la enzima de síntesis de la acetilcolina, la colina acetiltransferasa). Los grupos en “disputa” eran, el de Whittaker en Cambridge y el de ustedes. ¿Podría contarnos algunas infidencias no reveladas?

Con respecto a este tema, puedo mencionar que Whittaker y sus colaboradores, empleando un shock osmótico y una técnica con gradiente para aislar la fracción de vesículas del cerebro de cobayo, confirmaron nuestros resultados sobre la localización de acetilcolina, pero sostenían que la colina acetiltransferasa no estaba relacionada con las vesículas sinápticas. Por sus resultados de distribución subcelular, señalaron que la colina acetiltransferasa se encontraba en la fracción soluble, como la lactato deshidrogenasa y como el ión potasio. Cuestionaron la validez de nuestros resultados sin tomar en cuenta una posible diferencia de especie y/o las diferencias técnicas entre los procedimientos empleados (Whittaker y col., 1964) [6]. En vista de esta conflictiva situación, nosotros re-investigamos la localización de colina acetiltransferasa en cerebro de rata y de cobayo y extendimos el estudio al cerebro de conejo y de paloma. Para las determinaciones de colina acetiltransferasa contamos con la colaboración del doctor McCaman, investigador visitante de la Universidad de Indiana, discípulo de Lowry, quien nos instruyó y aportó una microtécnica muy sensible empleando [14C]acetil CoA y colina como sustratos. Además, hicimos un estudio comparativo de las técnicas de fraccionamiento celular empleadas en el laboratorio de Whittaker y el nuestro, teniendo en cuenta los detalles de centrifugación diferencial y el tratamiento osmótico. Con esos datos concluimos que la discrepancia en los resultados obtenidos en ambos laboratorios se explicaba por las diferencias metodológicas en el fraccionamiento subcelular y a la diferencia de especie en la distribución subcelular de colinaacetiltransferasa (McCaman y col., 1965) [7].

¿Cómo ve la situación actual de la investigación científica en la Facultad comparada con la de su época? ¿Qué tendríamos que mejorar?

Los estudiantes que egresan de esta Facultad están muy bien preparados para la investigación científica. Los conocimientos que recibieron de excelentes docentes que los han ido formando y capacitando en el transcurso de la Carrera explican que la actuación y el desempeño de nuestros egresados son bien reconocidos aquí y en el exterior,

Para mejorar sería esencial tener una mayor disponibilidad de recursos materiales y una adecuada retribución salarial.

¿Qué enseñanzas le ha dejado el haber trabajado con De Robertis?

Muchas y muy importantes. Su dedicación y fervor por la investigación científica eran notables. Su continuo interés por los nuevos resultados que se producían en el laboratorio era un índice de su permanente espíritu de juventud.

Fue un trabajador incansable. Estimulaba a todos a su alrededor. Aprendía de todos, sin distinción de cargo, edad, trayectoria, género…

¿Qué les diría a los jóvenes que hoy se inician en la investigación científica?

Que es fascinante. Con esta actividad, a veces, la mente transita por caminos totalmente nuevos, inexplorados…

Les diría también que siempre tengan la mente abierta… Puede ocurrir que los resultados de un experimento no concuerden, o que sean totalmente opuestos a la hipótesis planteada. Esa situación genera un nuevo desafío y lleva a buscar otras posibles interpretaciones, a estudiar otros enfoques experimentales, etc.

Que sean persistentes. El resultado de un primer experimento puede ser excelente,pero es esencial que el investigador lo repita de manera integral antes de darlo a conocer. Son tantos los detalles que pueden influir en el resultado final que no alcanza con la simple repetición de la medida del ensayo, sino que es crucial repetir íntegramente todo el experimento.

Como conclusión, si alguien me preguntara si repetiría el camino recorrido, respondería que sí, con la posibilidad actual de acceso a la información bibliográfica.

De todas maneras, lo imprescindible es tener buenas ideas y ganas de trabajar…

Georgina Rodríguez de Lores Arnaiz es doctora por la Universidad de Buenos Aires (UBA), investigadora superior del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) en el Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET-UBA. Miembro emérito de la International Society for Neurochemistry, la American Society for Neurochemistry y la Society for Neuroscience.

Entrevistó: Mariano Boccia, bioquímico y farmacéutico; doctor de la Universidad de Buenos Aires (UBA); profesor asociado de Farmacología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA; e investigador del CONICET.

Referencias bibliográficas

[1] De Duve, C.; Pressman, B. C.; Gianetto, R., Watteaux, R., Appelmans, F. (1955) Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue. Biochem. J. 60, 604–617.

[2] Gray, E. G.; Whittaker, V. P. (1962).The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.J. Anatomy, 96 (Pt. 1), 79–88.

[3] De Robertis, E.; Rodríguez de Lores Arnaiz, G.; Pellegrino de Iraldi, A. (1962). Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature (London) 194, 794‑795.

[4] De Robertis, E.; Rodríguez de Lores Arnaiz, G.; Salganicoff, L.; Pellegrino de Iraldi, A.; Zieher, L. M. (1963). Isolation of sy­nap­tic vesi­cles and structural organization of the acetylcholine system within brain nerve endings. J. Neurochem. 10, 225‑235.

[5] De Robertis, E.; Pellegrino de Iraldi, A.; Rodríguez de Lores Arnaiz, G.; Salganicoff, L. (1962). Cholinergic and non‑cholinergic nerve endings in rat brain. I. Isolation and subcellular distribution of acetylcholine and acetylcholinesterase. J. Neurochem. 9, 23‑35.

[6] Whittaker, V. P.; Michaelson, I. A.; Kirkland, R. J. (1964). The Separation of Synaptic Vesicles from Nerve-Ending Particles ('Synaptosomes'). Biochem. J. 90, 293-303.

[7] McCaman, R.E.; Rodríguez de Lores Arnaiz, G.; De Robertis, E. (1965). Species differences in subcellular distribution of choline acetylase in the CNS. A study of choline acetylase, acetylcholinesterase, 5‑hydroxytryptophan decarboxylase and monoamine oxidase in four species. J. Neurochem. 12, 927‑935.