Desde un abordaje nanobiotecnológico, hemos optimizado procesos para producir, en larvas de insectos autóctonos, dos citoquinas veterinarias destinadas al tratamiento de mascotas.

Se trata del interferón omega felino, con actividad antiviral y antitumoral similar al producto actualmente disponible de la empresa Virbac, pero que no se comercializa en la Argentina, y un nuevo producto no comercializado a nivel mundial, el interferón beta felino que registra un alto poder antitumoral.

En Biotecnología, la expresión de proteínas recombinantes es un campo en constante crecimiento. Los insectos del orden Lepidóptera infectados con baculovirus recombinantes han surgido como una interesante alternativa para expresar altos niveles de proteínas, especialmente aquellas con modificaciones postraduccionales y que no pueden producirse en sistemas tradicionales como bacterias y levaduras. Estos insectos, que se encuentran ampliamente distribuidos en el mundo, pueden utilizarse como pequeñas fábricas de proteínas llamadas “biofábricas”.

En países asiáticos, algunas especies como Bombyx mori, vulgarmente conocido como gusano de seda, fueron utilizadas para producir un gran número de proteínas recombinantes destinadas a diferentes usos industriales, tanto en ciencia básica como en aplicada, varias de las cuales ya han sido comercializadas. Alternativamente, otras especies que constituyen plagas en América y Europa como Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Rachiplusia nu, Helicoverpa zea, y Trichoplusia ni también pueden aprovecharse para la expresión de proteínas.

La utilización de larvas de insectos para estos fines biotecnológicos tiene como atractivo el bajo costo en comparación con procesos basados en cultivos de líneas celulares de insectos. Investigadores del Instituto de Nanobiotecnología (NANOBIOTEC, UBA-CONICET), de la Cátedra de Biotecnología, estudian esta plataforma para la expresión de proteínas de interés comercial que incluyen enzimas, hormonas, antígenos para diagnóstico y vacunales.

Hace ya mucho tiempo que la Tierra es de los insectos. Tras su entrada en escena, hace unos 350 millones de años, los insectos han escapado a todos los cataclismos ocurridos en la historia geológica de nuestro planeta. Sobrevivieron a importantes extinciones, la que tuvo lugar hace 250 millones de años y que acabó con casi el noventa por ciento de las especies existentes en aquel período y, más adelante, hace unos 65 millones de años la que exterminó a los dinosaurios. Y siguieron evolucionando y ocupando todos los rincones de la Tierra, mucho antes de que llegase el hombre, hace apenas medio millón de años.

Los científicos han explicado que, excluyendo las bacterias, los insectos representan más de la mitad de la biodiversidad del mundo, por lo que se los considera el grupo terrestre con más éxito desde el punto de vista evolutivo en la historia de la vida. Ya se han descripto más de un millón de especies diferentes dentro de la clase Insecta y, es muy probable que todavía no se conozca más que una cuarta parte de todas las especies de insectos existentes.

El hombre ha sabido sacarles provecho, el ejemplo más claro puede que sea la producción industrial de miel de abeja, un alimento natural y saludable. Otro insecto muy utilizado es la cochinilla, de ella se obtiene el conocido pigmento “rojo cochinilla” insumo de las industrias farmacéutica, cosmética y alimentaria. Los países asiáticos desarrollaron una industria textil alrededor del gusano de seda o Bombyx mori, como productor de hilos de seda.

Sin embargo, y claramente, en esa inmensa diversidad, no todos los insectos son de nuestro agrado. Algunas especies de orugas suelen ser un verdadero dolor de cabeza para el hombre de campo, ya que constituyen plagas importantes para la agricultura. En particular, las orugas o larvas de insectos del orden Lepidóptera, comúnmente conocidas como mariposas y polillas, que son fitófagas y se alimentan con gran voracidad de tallos, hojas, flores, frutos e incluso raíces.

Así, las larvas de Spodoptera frugiperda, conocida comúnmente como la "oruga militar tardía" --ya que se desplaza en masa de un cultivo a otro, como un regimiento-- y de Rachiplusia nu, conocida como "oruga medidora" --por su forma de trasladarse, como si estuviera ´midiendo´ el terreno, porque tiene solo tres pares de pseudopatas-- devoran cultivos de soja, maíz, algodón, alfalfa, lino, papa, tomate y sorgo. También constituyen un problema para huertas y jardines, ya que se alimentan de distintas especies de plantas; los tréboles y lupinos constituyen sus bocados preferidos.

Hoy, gracias a la aplicación de herramientas biotecnológicas, existen por ejemplo gusanos de seda genéticamente modificados para producir hilos de seda de colores. Y más aún, los científicos lograron obtener de los gusanos de seda algo muy diferente: fármacos de uso veterinario. Tal es el caso, por ejemplo, de Virbagen Omega, un producto desarrollado por el laboratorio francés Virbac. Se trata de un interferón-omega felino que se usa para disminuir los síntomas y prolongar la supervivencia de gatos infectados con el virus felino del herpes, calcivirosis, peritonitis, leucemia e inmunodeficiencia, entre otros casos.

Esto abrió la puerta al uso de gusanos de seda como verdaderas biofábricas de proteínas de interés comercial especialmente para el área veterinaria. En la Argentina, la producción de gusanos de seda es pequeña y artesanal, destinada al sector textil. Ahora bien, en América latina predominan otros gusanos que pueden calificar para estos emprendimientos biotecnológicos en la búsqueda de nuevos biofármacos o proteínas que se apliquen como insumos para diagnóstico. Es el caso de las larvas de R. nu y S. frugiperda, capaces de crecer en condiciones de laboratorio.

Pero las larvas de insectos tienen un enemigo natural, el baculovirus. Este virus pertenece a la familia Baculoviridae, que engloba a un amplio grupo de virus DNA que sólo infectan a invertebrados, fundamentalmente a insectos de los órdenes Lepidóptera, Díptera e Hymenoptera. Dada su letalidad y su especificidad, desde mediados del siglo XX, los baculovirus han sido usados como biopesticidas.

PONER A TRABAJAR A LARVAS AUTÓCOTONAS

En nuestro laboratorio hemos explorado el uso de larvas de R. nu, entre otras plagas autóctonas, como biofábricas para la producción masiva de proteínas heterólogas de interés comercial. Utilizamos como vector el virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y lo modificamos genéticamente para que produzca altas concentraciones de la proteína de interés una vez que infecta la larva en condiciones controladas de laboratorio.

El proceso para lograr este objetivo es complejo. Con el uso de herramientas de biología molecular suplantamos el gen de poliedrina viral, una proteína esencial para la supervivencia del virus en la naturaleza, por el gen de la proteína de nuestro interés.  Esta modificación genética no altera el ciclo de vida del virus, y nos permite obtener altos niveles de producto cuando se utiliza el virus como vector para infectar por inoculación a lotes de larvas en el laboratorio. 

Si bien Bombyx mori es un agente muy eficiente como biofábrica, la proteína recombinante suele expresarse en hemolinfa y los métodos de purificación incluyen la extracción de la hemolinfa de cada una de las larvas infectadas, lo que resulta poco práctico en procesos a gran escala. Por otra parte, tiene en sí misma como productor de seda un valor comercial.

En cambio, especies autóctonas como S. frugiperda, H. zea, H virescens y T ni son plagas en nuestro territorio y no tienen valor económico. Es interesante entonces explorar estas larvas como huéspedes alternativos para expresar proteínas recombinantes. El rendimiento de proteínas recombinantes que contengan modificaciones postraduccionales puede alcanzar valores en el rango de microgramos o miligramos por larva, lo que sumado a los bajos costos de producción hacen a esta plataforma sumamente atractiva y alternativa a los huéspedes tradicionales como las levaduras o las células de mamíferos. Con una instalación automatizada para la cría masiva, y condiciones de trabajo controladas, es posible el escalado para tener una producción de hasta varios kilogramos de proteína recombinante por semana.

La producción y la comercialización de biofármacos veterinarios requiere del desarrollo de esquemas de expresión y purificación de biomoléculas económicos y aptos para su escalado y las biofábricas son una interesante opción. En nuestro laboratorio nos preguntamos si podríamos reproducir el producto veterinario para el tratamiento de mascotas (perros y gatos) que había lanzado la empresa Virbac en gusano de seda. Comenzamos a trabajar en este proyecto cuando supimos que en nuestro país este producto no se comercializaba y, en su lugar, se administraba a las mascotas interferón alfa humano recombinante.

Hoy podemos decir que tenemos procesos optimizados para la producción en larvas de insectos autóctonos de dos citoquinas veterinarias, el interferón omega felino con actividad antiviral y antitumoral similar al producto de Virbac y un nuevo producto que no se comercializa a nivel mundial, el interferón beta felino con alto poder antitumoral.

Cría e infección de larvas de R. nu y S. frugiperda en laboratorio

A: Larva de R. un.

B: Larva de S. frugiperda.

C: Cría de larvas en placas multipocillo.

D: infección intrahemocélica con baculovirus recombinante.

Glosario

Biopesticidas: son pesticidas derivados de materiales naturales tales como animales, plantas, bacterias, virus y ciertos minerales.

Proteínas heterólogas: son aquellas que se obtienen mediante herramientas de ingeniería genética en una especie o una línea celular distinta a la célula original.

Modificaciones postraduccionales: son cambios químicos que sufren las proteínas después de su síntesis. 

Biofármaco: es un producto medicinal, terapéutico, profiláctico, o de diagnóstico in vivo, cuyo principio activo es de naturaleza biológica y es producido por Biotecnología.

Alexandra M. Targovnik, Mariana B. Arregui, Gregorio J. Mc Callum, Ignacio Smith, Lautaro F. Bracco, Agustín A. Navarro del Cañizo, Federico J. Wolman, Osvaldo Cascone y María V. Miranda.

Instituto de Nanobiotecnología (NANOBIOTEC, UBA-CONICET). Cátedra de Biotecnología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.